1.1 유전자 사격법으로 얻은 유전자 변형 밀은 1992 년 현대 생명기술로 밀을 개량하는 데 역사적인 한 해였다. Vasil 등 장기간 배양된 배아성 캘러스를 외식체로 하여 GUS/Bar 유전자를 밀 품종' Pavon' 에 도입해 제초제 Basta 에 대한 저항성 재생식물 (T) 과 그 뒤 (T1) 를 얻어 세계 최초의 유전자 변형 밀의 출현을 선언했다. 1 년 후, 같은 연구팀은 미성숙 배아와 그 치유 조직을 외식체로 하여 3 개의 밀 유전자형 (Pavon, Bobwhite, RH7719) 에서 성공하고 유전자 변형 밀 식물을 얻는 시간을 15 개월에서 7-9 개월로 줄였다. 올해 Weeks 등도 품종' Bobwhite' 의 미성숙한 배아를 외식체로 유전자 사격법을 통해 유전자 변형 밀 식물을 얻었다고 보도했다. 두 개의 독립된 실험실은 같은 품종 (Bobwhite) 의 같은 조직 (미성숙 배아) 과 같은 방법 (유전자 총법) 으로 동일하거나 비슷한 결과 (유전자 변형 식물 획득) 를 얻어 사용된 유전자 변형 방법이 믿을 만하다는 것을 보여준다. 이후 미성숙한 배아 (또는' 미성숙 배아') 와 그 파생물을 외식체로 유전자 사격법을 통해 유전자 변형 밀을 얻는 보도가 날로 늘어나면서 지금까지 밀 유전자 전달의 주요 방법이 되고 있다. 밀 배아 꼭대기 분생 조직, 영양체 꼭대기 분생 조직, 화서 분생 조직을 목표로' 휴대용' 유전자총으로 사격해도 외원 유전자의 즉각적인 표현과 유전자 변형 식물을 얻을 수 있다는 점도 주목할 만하다. 이 방법은 전능성 세포 수의 문제를 우회할 수 있으며, 밀 유전자 전달에서 어느 정도의 잠재력을 가지고 있다. < P > 1.2 꽃가루관 통로법으로 얻은 유전자 변형 밀은 꽃가루관 통로법을 이용해 밀을 전도하는 작업이 주로 지난 5 년 (199-1995) 에 집중되었으며 주로 우리나라에 집중되고 있다. 주문린 등은 C4 작물의 DNA 를 꽃가루관을 통해 봄밀에 도입해 C4 의 여러 가지 특성을 지닌 형질 전환' 유전자' 밀과 그 후손을 얻었다고 보도했다. 성탁민 등은 밀 황색 왜소 바이러스 CP 유전자를 획득한 밀, 증군지 등 유근지 등도 화분관 통로법 유전자 변형 밀의 획득을 보도했다. 유감스럽게도, 당시 이 보도들은 유전자 변형 밀 식물과 그 후손들 사이에서 외원 유전자 (또는 DNA) 가 완전하고 표현한 분자 생물학 증거가 부족했다. 최근 Zeng (증군지) 과 Wu 등은 199-1994 년 꽃가루관 통로법을 통해 얻은 유전자 변형 밀의 후손에 대한 외원' 유전자' 표현 분석을 실시했다. 분자생물학 방법 분석을 포함해 외원 유전자의 통합과 표현을 입증해 꽃가루관 통로법을 통해 유전자 변형 밀을 얻을 수 있다는 것을 증명했다. 주문린, 건복 등 (개인통신) 은 우리가 만든 eMS/Bar 키메라 유전자로 밀을 전달해 제초제 저항성과 수컷 불임 특성을 가진 식물을 얻었고, 그 후손들은 여전히 제초제에 대한 저항성을 보이고 있다. 화분관 통로법은 복잡한 조직 배양, 식물 재생 과정을 피하며 밀에 잠재력이 있는 유전자 전달 방법이다. < P > 1.3 기타 직접법으로 얻은 유전자 변형 밀 기타 직접법 (예: 마이크로주사, 레이저 마이크로빔 천자, PEG 매개, 전기 자극 등 밀에 대한 전환은 거의 효과가 없다. 이러한 직접적인 방법으로 처리한 원생체와 세포에서 외원 유전자가 순간적으로 표현되거나 심지어 생기는 치유 조직에서도 안정적으로 표현될 수 있다는 연구결과가 많이 나왔지만 유전자 변형 밀 식물의 보도는 단 한 건밖에 없다. He 등은 품종' Hartog' 의 원형질체를 수용체로, 전기자극법을 통해 제초제 (PPT) 저항성을 가진 녹색 유전자 변형 식물을 얻었지만, 이 식물들은 씨를 맺지 못했다. 밀 원질체나 단세포 식물 재생의 어려움은 전기격법, PEG 법, 현미주사법 등 직접법이 밀 유전자 조작에 실패한 주요 원인일 수 있다. 바로 이런 어려움 때문에 원형질체나 단세포를 수용체로 하는 직접법이 밀 유전자전도에 대한 전망을 어둡게 만들었다. < P > 1.4 농균 매개법으로 얻은 유전자 변형 밀은 1983 년 첫 그루 농균 (Agrobacterium tumefaciens) 매개 형질 전환 식물의 출현으로 곧 쌍자엽 식물 유전자 전달의 주도 방법이 되었다. 이 방법은 조작이 쉽고, 비용이 저렴하며, 변환 효율이 높고, 단일 복사 유전자 통합률이 높으며, 외원 유전자는 유전자 변형 식물의 후손들 사이에서 비교적 안정적이다. 이 방법을 밀을 포함한 단엽식물의 유전자전도에 도입해 9 년대 전후 토론과 연구의 핫스팟이 될 수 있을까. 당시, 한 경향적인 견해는 단자엽식물이 농균의 천연 기주가 아니었으며, 농균을 이용하여 단자엽식물을 중계하는 것은 거의 불가능하거나 불가능했다는 것이다. (알버트 아인슈타인, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 계절명언) 이런 관점의 대표적 인물은 밀 등 곡류 작물 조직 양성과 유전자 총전도 방면에서 탁월한 성과를 거둔 스위스 과학자 Potrykus 로 국제 권위 잡지' Bio/Technology' 와' Nature' 에서 그의 비관적인 논점을 발표했다. 아그로 박테 리움 매개 형질 전환 식물의 획득, 특히 아그로 박테 리움 매개 형질 전환 벼와 형질 전환 옥수수의 획득은 단엽 식물이 아그로 박테 리움의 천연 숙주가 아니라는 견해를 바꿀뿐만 아니라 아그로 박테 리움 매개 방법이 곡물 작물의 유전 적 전환에 완전히 사용될 수 있음을 입증했다. < P > 밀에서는 이미 1988 년 이미 농균이 침투해 유전변이를 할 수 있다는 사실이 증명됐지만, 이후 농균이 일부 효소 분해와 효소를 거치지 않은 밀 배아세포에 부착될 수 있다는 사실이 증명됐지만, 여러 해 동안 유전자 변형 식물을 얻지 못했다. Hess 등에 따르면 농균을 작은 이삭에 직접 접종해 항생제성과 Southern Blot 교잡으로 입증된 유전자 변형 당대 식물을 얻었지만, 외원 유전자 부분은 F1 과 F2 에서 외원 유전자의 존재를 감지하지 못했다고 한다. 인공수분 후 * * * 합체 (pCV226 과 pSIR42) 를 휴대한 농균 (주계 C158) 으로 암술을 처리하고, Pukhal'skii 는 PCR 과 Southern Blot 교잡으로 증명된 F1 식물을 얻어 외원 유전자를 가진 F2 식물을 얻는다. 이 간단한 유전자 변환 방법은 꽃가루 통로와 농균 침투의 장점을 결합해 다른 실험실에서 입증할 수 있다면 밀 등의 유전자 전환에 주도적인 역할을 할 것이다. < P > 농균이 밀 유전자전도를 매개하는 방면에서 Cheng 은 1997 년 1 여 년간의 침묵을 깨고 처음으로 얻은 정상 유전자 변형 밀 식물이다. 2 년 후 우리나라 과학자 하광민 등 보도가 농균 매개 유전자 변형 밀 식물을 얻었고, 필자 연구팀도 농균 매개 유전자 변형 밀 식물 (발표 예정) 을 얻는 데 성공했다. 이런 성공은 밀도 쌍자엽 식물처럼 농균매개 유전자 전환의 모든 장점을 누릴 수 있다는 것을 의미한다. < P > 아그로 리스틱 (Agrolistic) 은 아그로 리스틱 (Agrolistic 초음파 보조 농균 매개법 (son ication-assisted agro bacterium-mediated transformation, SAAT Singh, Chawla, Serik 등은 실리콘 카바이드 섬유 (silicon carbide fibeers) 를 이용하여 농균 유전자 변형을 돕는다. 또 농균과 바이러스를 결합한' Agroinfection' 법 등도 있다. 이 방법들은 아직 성숙하지는 않았지만 밀 유전자 전달 방면에서 큰 잠재력을 가지고 있다.
2, 밀 유전자 변형의 수용체 < P > 는 유전자 전환의 수용체로서 사용된 유전자 변형 방법에 따라, 수용체 조작의 난이도가 유전자 변형 방법의 성패를 결정한다. < P > 밀 배아성 공중부양세포와 그 분리된 원형질체는 전기충격법, PEG 법, 현미주사법 등 직접 유전자 조작법의 수용체로 많이 쓰인다. 바로 원형질체와 공중부양세포 재생식물의 어려움 때문에 전기격법 등 직접법은 밀의 유전자 변환 방면에' 용무지' 가 별로 없다. 밀의 배아성 캘러스, 특히 미성숙 배아와 그 캘러스 및 미성숙 배아 방패와 그 캘러스는 비교적 강한 식물 재생 능력 (일부 사람들은 비교적 큰 비율의 전능성 세포를 가지고 있다고 생각한다) 을 가지고 있으며, 유전자 총법의 수용체와 농균 매개 수용체로 유전자 변형 식물을 재생할 수 있어 지금까지 밀 유전자 변형의 주요 수용체가 되고, 유전자 총법이 현재 밀의 주요 유전자 변형 방법이 될 수 있으며, 농균 매개 방법을 미래로 만들 수도 있다 필자연구팀의 최근 실험 결과 (발표 예정) 에 따르면 밀 화약 캘러스의 재생 능력이 강해 유전자총 폭격 후 유전자 변형 식물을 쉽게 얻을 수 있어 밀 유전자 변형의 좋은 수용체이기도 하다. 밀의 각종 분생 조직은' 휴대용' 유전자총의 수용체로서 큰 이용 잠재력을 가지고 있지만, 이 잠재력의 발휘는 아직 이런 유전자총 자체의 완벽성과 경제적 활용성이 있어야 한다. 암술, 꽃가루관 통로법 및 농균 1 꽃가루 통로법의 유일한 수용체로서, 이러한 유전자 변형 방법이 보완됨에 따라 밀 유전자 변형 방면에서 점점 더 중요한 역할을 하게 될 것이며, 주도적인 역할을 할 수 있을 것이다. 밀 유전자 변형 수용체로서 포자, 꽃가루, 포자, 엽기가 더 개발될 수 있지만 가까운 장래에 주요 수용체가 될 수는 없다. 어린 이삭은 밀 유전자를 좋은 수용체로 전환시키는 것일 수 있다. 진양홍은 어린 이삭과 배아를 수용체로 비교하는 변환 실험에서 어린 이삭의 변환 효과가 배아보다 낫다는 것을 관찰했다.
3, 밀 유전자 전환의 목표유전자와 선택 < P > 표지유전자는 지금까지 쌍자엽 식물 유전자 전환에 일반적으로 사용되는 선택유전자와 보고유전자는 여전히 밀 유전자 전환의 목표유전자이자 선택유전자로 많이 사용되고 있다. 이들 유전자는 주로 유전자류를 보고하는 GUS, CAT, LUC 가 있다. 항항생제류의 NptII, Hpt, 항제초제의 Bar, EPS, Bxn, CP4, GOX 입니다. 이 유전자들은 밀에서 주로 효과적인 유전자 변형 시스템을 구축하기 위해 이용된다. 밀 유전자 변형 체계의 건립과 보완에 따라 밀 형질을 개선하기 위한 진정한 목표유전자의 이용이 늘고 있다. 지금까지 밀을 도입하고 유전자 변형 식물에서 표출된 목표 유전자는 1 밀 가공 품질을 개선하는 유전자, 즉 HMW Glutenin subunit 유전자 lAxl, lDx5, lDxl, 재조합 고분자 글루텐 아기 유전자이다. ② 항병 유전자: 바이러스 껍데기 단백질 유전자 (Coat protein genes, CP), 싹트린 단백질 (germin-like proteins, GLPs) 유전자, 벼 thaumatin-like 단백질 유전자 TLP ③ 키메라 수컷 불임류 유전자: 리보 핵산효소 유전자 Barnase, 세포 골격 단백질 유전자 등 ④ 제초제 내성 유전자: Bar, EPSPs, Bxn, CP4, GOX. < P > 쌍자엽 식물에서 유전자를 선택하는 항항생제 유전자 (예: NptII, Hpt 등) 로 밀 유전자 조작에 적용이 적다. 주된 이유는 두 가지가 있다. 첫 번째는 밀이 Kan 에 대해 높은 천연 저항성을 가지고 있고, 두 번째는 밀에 항생제 유전자가 함유된 안전성에 대한 우려가 있다는 것이다. 지금까지 유전자 변형 밀에서 가장 많이 사용된 선택 유전자는 제초제 내성 유전자 Bar 이다. < P > 리포터 유전자 GUS, CAT, LUC 는 밀 유전자 변환 체계의 설립에 큰 기여를 했다. 하지만 밀 유전자 변형 체계가 기본적으로 성숙해진 오늘날, 사람들은 위에서 언급한 단순한 보고 유전자 대신 다른 유전자를 찾거나 보고 유전자를 전혀 이용하지 않기 시작했다. 외관상 보이는 보고 유전자 (visual marker) 를 언급할 만하다. Cl/Lc 와 같은 McCormac 및 Mentewab 와 같은 안토시아닌 생합성촉진 유전자 (Anthocyanin Biosynthesis Stimulator Y Genes) 는 보고 유전자로서 수용체와 그 세포의 색상을 변환함으로써 변형자를 선택한다. 이것은 광범위한 응용가치를 지닌 보고 유전자이다. 또한 합성된 녹색 형광 단백질 유전자 (SGFP-S65T) 도 밀의 유전자 전환을 보고하는 데 사용되었습니다.
4, 유전자 변형 밀에서 외원 유전자의 표현과 표현 분석 < P > 은 유전자 변형 식물에서 외원 유전자를 구성하는 프로모터 CaMV 35s 가 곡물류에서 작용하는 역할이 약하다는 데 널리 사용되고 있다. 유전자 변형 밀에서 외인성 유전자의 발현을 강화하기 위해 사람들은 이중 CaMV35s 서열을 이용하거나 단엽식물 유전자의 삽입물 (예: 옥수수 Adhl 유전자의 삽입물) 을 넣거나, 대신 단엽식물 유전자의 시동자 (예: 벼의 Actl 유전자의 시동자 및 옥수수 Ubil 유전자의 시동자) 를 이용한다. Actl 과 Ubil 프로모터는 현재 밀 유전자 변형에서 가장 널리 사용되는 구성형 프로모터이다. 또한 인공재조합형 프로모터 pEmuGN 은 유전자 변형 밀 등에서 외원 유전자의 표현 강도를 CaMV35s 보다 최소 1 배 이상 높였습니다. 이런 종류의 재편성 시동자는 밀의 유전적 변이에 큰 역할을 할 것이다. < P > 조직 및/또는 장기 특이성 표현 프로모터의 응용은 밀 유전자 변형에서 큰 발전이다. 특히 주목할 만한 것은 화약 꽃가루 특이성 시동기의 이용이다. De Block 등은 벼화약 펠트층 특이성 시동자인 ca 구동 리보핵산효소 유전자 Barnse 를 유전자 변형 밀에서 표현하여 세계 최초의 유전공학 수컷 불임 밀을 만들었다. 필자의 연구팀은 담배 화약 펠트층 특이성 시동자인 TA29 를 이용해 유전공학 수컷 불임 밀을 만들었다. 유전공학 수컷 불임 밀의 보완과 배합은 현재 잡교 밀 제종의 난이도를 완전히 바꿀 것이다. 또한 화학적 유도성 시동자는 유전자 변형 밀에도 엄청난 응용 잠재력을 가지고 있다. < P > 최근 몇 년 동안 유전자 변형 밀에 대한 대외원 유전자의 통합, 표현 방식은 분자 방면의 연구를 포함한 일정한 연구가 있었다. 일반적으로 유전자 변형 밀에 대한 외원 유전자의 통합 방식은 사용된 유전자 변형 방법과 관련이 있다고 생각하지만, 유전자 총이나 농균 매개법을 사용하든, 낮은 사본과 간단한 통합이 여전히 우세하다.