비대칭 프라이머의 응용?

비대칭 PCR (비대칭 PCR 은 서로 다른 양의 유인물을 사용하여 PCR 이 증폭된 후 대량의 단일 체인 DNA(SSDNA) 를 생성합니다. 이들 프라이머는 각각 비제한적 프라이머와 제한적 프라이머라고 불리며, 그 비율은 일반적으로 50 ~ 100: 1 이다. PCR 반응의 처음 10 ~ 15 개 사이클에서 증강산물은 주로 이중 체인 DNA 이지만 제한 프라이머 (저농도 프라이머) 가 소진되면 비제한 프라이머 (고농도 프라이머) 가 유도하는 PCR 이 많이 생성됩니다 비대칭 PCR 의 핵심은 제한 프라이머의 절대량을 제어하는 것으로, 두 프라이머의 비율을 여러 번 탐색하고 최적화해야 한다. 또 다른 방법은 먼저 같은 농도의 프라이머로 PCR 증폭을 하여 이중 체인 DNA (dsDNA) 를 준비하는 것이다. 그런 다음 이 dsDNA 를 템플릿으로 사용합니다. 이 중 하나는 두 번째 PCR 에서 ssDNA 를 준비하는 데 사용됩니다. 비대칭 PCR 을 통해 준비한 ssDNA 는 주로 핵산 서열 측정에 사용된다. 비대칭 PCR 의 기본 원리는 서로 다른 쌍의 프라이머를 이용하여 대량의 단일 체인 DNA(ss-DNA) 를 생성하는 것이다. 이 두 가지 프라이머를 각각 제한 프라이머와 비제한 프라이머라고 합니다. 최적 비율은 일반적으로1:50 ~1:100 이며, 핵심은 프라이머의 절대량을 제한하는 것입니다. 제한적인 프라이머가 너무 많고 너무 적으면 ss-DNA 의 준비에 불리하다. 일반 PCR 을 사용하여 표적 DNA 이중 가닥 DNA(ds-DNA) 를 준비한 다음 ds-DNA 를 템플릿으로 사용하여 과다 유인물 중 하나만 사용하고 단일 유인물 PCR 을 통해 ss-DNA 를 준비할 수도 있습니다. 생성된 ds-DNA 와 ss-DNA 는 분자량이 다르기 때문에 전기 영동에서 분리되어 순수한 ss-DNA 를 얻을 수 있다. 비대칭 PCR 은 주로 ss-DNA 를 준비하는 데 사용됩니다. 특히 CD-Na 비대칭 PCR 은 진핵 DNA 외현자를 연구하는 좋은 방법이다.

비대칭 PCR 증폭 방법, 특수 프라이머 및 그 응용

특허 출원 번호는 CN2004 10056866.0 입니다.

특허 출원일: 2004 년 8 월 26 일

비대칭 PCR 증폭 방법 및 특수 프라이머 및 그 응용

발표 (공고) 호 CN 1629305

발행일 (공고) 2005 년 6 월 22 일

분류 화학 야금학

인증 날짜

우선권

신청 (특허) 베이징 boo 바이오칩 유한 회사 칭화대학교

주소 102206 베이징시 창평구 생명과학원로 18 호

발명가 (디자이너) 장 지웨이; 왕 웨이; 주령상 장경 경정

국제신청

국제 공고

입국 날짜

특허 대리인 베이징 jikai 지적 재산권 기관 유한 회사

관청 요원

요약

본 발명은 비대칭 PCR 증폭 방법 및 전용 프라이머와 응용을 공개하여 단일 체인 증폭산물을 간단하고 효율적으로 준비할 수 있는 PCR 증폭법을 제공하기 위한 것이다. 본 발명은 여러 쌍의 PCR 프라이머 쌍을 포함한 비대칭 PCR 프라이머를 제공하며, 각 프라이머 쌍 중 한 쌍의 프라이머 5' 끝에 증폭될 타겟 시퀀스와 무관한 과뉴클레오티드 꼬리를 추가하는 것이 특징이다. 본 발명에서 제공하는 비대칭 PCR 증폭 방법에는 1) 사전 변성 단계가 포함됩니다. PCR 증폭의 첫 번째 부분은 여러 개의 트랜스젠더, 프라이머 어닐링 및 프라이머 확장 루프를 포함합니다. PCR 증폭의 두 번째 부분은 몇 가지 변성과 프라이머 확장 순환을 포함한다. 프라이머 확장을 위한 PCR 프라이머 쌍 중 하나의 프라이머 5' 끝에 증폭될 과녁 시퀀스와 무관한 과뉴클레오티드 꼬리를 추가합니다. 본 발명품의 비대칭 PCR 증폭 방법은 단일 체인 생산률이 높으며 단일 또는 다중 PCR 증폭을 수행할 수 있어 핵산검사 용도로 널리 사용될 수 있습니다.

주권 용어

1. 비대칭적 PCR 프라이머 (PCR 프라이머 쌍 몇 쌍 포함) 로, 각 프라이머 쌍 중 하나의 프라이머 끝에 증폭될 대상 시퀀스와 무관한 과핵산 꼬리를 추가하는 것이 특징입니다.

PCR 제품의 직접 시퀀싱

PCR 증폭 표적 서열의 겔 정제

최적의 PCR 반응 조건이 필요한 특이성 산물을 생산하지 못하면 새로운 과뉴클레오티드로 재증폭하거나 겔 전기 영동으로 다른 PCR 산물을 분리한 다음 각 PCR 산물을 재증폭시켜 서열 분석을 할 수 있다. 길이가 다른 조각은 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분리 될 수 있습니다:

1. 조각 크기가 80- 100bp 인 경우 3%NuSieve 1% 일반 아가로 오스 또는 폴리아크릴 젤로 분리할 수 있습니다.

2. 남아프리카에서 온 PCR 조각이 들어 있는 슬라이스를 접착제에서 잘라냅니다.

3. 50 ∼100 μ LTE 침지 필름을 첨가하면 몇 시간 동안 반복해서 냉동하거나 두어 DNA 를 접착제에서 확산시킬 수 있다.

4. 소량 (1-5%) 을 취하여 2 차 증폭을 합니다. 순수한 단일산물을 얻기 위해서는 두 번째 PCR 증폭에 사용되는 젤 추출물의 양이 65438±0 ng 미만이어야 합니다.

5. 진지당에는 탭 중합 효소 활성을 억제하는 물질이 함유되어 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, Tab 중합 효소 시퀀싱을 위해 단편을 다시 증폭해야 한다면 아크릴 아미드 전기 영동으로 분리하는 것이 좋다.

PCR 프라이머를 사용하여 길이가 같은 관련 시퀀스를 몇 개 증폭할 때, 예를 들어 새로 복제된 유전자, 반복 시퀀스 또는 보수 신호 시퀀스의 동일한 프라이머와 같이 다음과 같은 두 가지 방법으로 전기 수영 분리를 개선할 수 있습니다. 1). 먼저 핵산 내체효소로 하나의 템플릿만 절단한 다음 전기 영동으로 전체 PCR 제품을 정제한다. 2) 서로 다른 뉴클레오티드 서열을 가진 증강산물을 분리하는 전기 수영 시스템. 다음 섹션에서는 이러한 시스템의 트랜스젠더 아미드 그라데이션 젤 시스템에 대해 설명합니다. 현재로서는 다른 PCR 산물 중 내체효소 부위를 미리 알아야 한다.

잡종의 직접 시퀀싱

두 개의 대립 유전자가 단일 부위의 돌연변이로 인해 다를 때, 잡합 부위는 PCR 프라이머를 사용하여 직접 서열을 해독함으로써 발견할 수 있다. 그러나 몇 개의 점 돌연변이나 삽입/누락 단편 세그먼트가 있는 대립 유전자 템플릿은 PC R 프라이머로 직접 서열을 매겨 복합 시퀀싱 사다리를 생성합니다. 몇 가지 융기를 결정하고, 잡합자에서 단일 등위 유전자의 서열을 얻는 네 가지 방법이 있다: 1). 서로 다른 템플릿 복제 및 분리 2) 서열을 서열화하기 전에 템플릿 간 뉴클레오티드 서열의 차이를 이용하여 전기 영동에 의해 서로 다른 템플릿을 분리한다. 3) 시퀀싱 반응에는 단 하나의 대립 유전자 만 개시된다. 4). 단 하나의 대립 유전자 만 증폭되었다.

시퀀싱 템플릿의 준비

PCR 제품의 직접 시퀀싱과 관련된 몇 가지 문제는 트랜스젠더 후 증폭 세그먼트의 두 체인을 빠르게 결합하여 시퀀싱 프라이머가 보완 시퀀스와 어닐링되거나 프라이머-템플릿 복합체의 확장을 막을 수 있다는 것입니다. 시퀀싱 반응에서, 모델 체인 재구성은 작은 부분의 모듈을 시퀀싱하여 최종 시퀀싱 스트립을 약화시킨다. 이 문제를 줄이기 위해 향상된 표준 이중 체인 DNA 시퀀싱 또는 PCR 을 통해 단일 체인 템플릿을 준비할 수 있습니다.

이중 가닥 DNA 템플릿

염기서열분석을 위한 템플릿을 준비하는 방법에는 두 가지가 있으며, 두 방법 모두 합가가 * * * 인 폐쇄 루프 이중 체인 플라스미드 템플릿의 순서를 결정하는 데 사용되었습니다. 이러한 방법으로 PCR 제품을 시퀀싱하는 것은 일반적으로 어렵습니다. 짧은 선형 템플릿이 이중 체인 플라스미드보다 재구성이 더 쉽기 때문입니다. 이 두 가지 방법 중 PCR 조각은 전기 수영 전에 젤 전기 수영이나 회전 투석을 통해 순수화할 수 있다.

1. 실온에서 템플릿은 0.2M NaOH 에서 5min 을 변성시키고 냉동하여 0.4 배의 5M 아세틸산 암모늄 (pH7.5) 중화반응을 첨가한다. 즉시 4 배의 부피의 무수에탄올로 DNA 를 침전시켰다. 적절한 어닐링 온도에서 시퀀싱 버퍼 프라이머를 추가합니다.

2. 온도를 95 C 5 분 동안 유지하여 템플릿을 변성시키고 얼음욕 (또는 드라이아이스 에탄올) 에서 원심관을 빠르게 냉각시켜 체인 재구성을 줄입니다. 시퀀싱 프라이머를 넣고 반응이 적절한 온도에 도달하도록 합니다. 시퀀싱 프라이머는 변성 전후에 첨가하기에 적합하다.

단일 가닥 DNA 템플릿

단일 체인 템플릿을 사용하면 시퀀싱에서 체인 재구성을 방지할 수 있습니다. 단일 체인 템플릿은 체인 분리 젤 또는 PCR 반응을 통해 이중 체인 DNA 템플릿에서 준비할 수 있습니다. 500bp 보다 큰 단일 체인 DNA 조각은 진지당 젤에서 분리할 수 있지만 짧은 단일 체인에는 적용되지 않습니다. 단일 체인 DNA 를 준비하는 또 다른 방법은 PCR 반응에서 바이오틴 마크의 프라이머를 사용하는 것입니다. 트랜스젠더 PCR 제품은 항바이오틴 단백질 기둥을 통해 두 개의 체인을 분리하며 바이오틴 표기 체인만 기둥에 결합할 수 있습니다. 그러나 가장 쉬운 방법은 향상된 PCR 방법을 사용하여 설정된 단일 체인 DNA 를 준비하는 것입니다. 이 반응 (비대칭 PCR, asymmetric PCR) 에서 처음 20-25 개 주기 중 2 개의 비대칭적인 증폭 프라이머는 이중 체인 DNA 를 생성하고, 제한 프라이머가 다 떨어지면 다음 5- 10 주기가 ssDNA 를 생성합니다. 약 25 사이클 후에 단일 체인 DNA 가 나타나기 시작했고, 제한된 프라이머 수가 거의 바닥났다. 짧고 빠른 상승 끝에 ssDNA 는 예상대로 선형 축적을 시작했는데, 당시 반응에는 유인물이 하나밖에 없었다. 다른 비율의 프라이머는 이런 형태의 ssDNA 를 생산한다. 일반적으로 100μlPCR 의 반응 시스템의 경우 프라이머 비율은 50pmo:0.5pmol 이며 30 회 순환 후 약 1-3pmol 의 ssDNA 를 생성할 수 있습니다. SsDNA 의 생산량은 다음과 같이 추정할 수 있다. A). PCR 반응에서는 정상적인 dDNA 외에도 32P-dNTP 를 첨가한다. 10% 의 반응산물을 얇은 3% NuSieve+ 1% 일반 진지당 젤에서 전기 영동하여 건조하고 필름과 함께 노출한다. B). 5% 반응물을 겔화하여 막으로 옮겨 ssDNA 와 보완되는 과뉴클레오티드를 탐침으로 교배하다. SsDNA 는 EB 염색을 통해 정량화할 수 없습니다. ssDNA 는 2 차 구조를 형성하는 경향이 있고 템플릿에 염료를 삽입하는 것은 무작위이기 때문입니다. 비대칭 프라이머 비율의 증폭 효율은 (70%) 80 ~ 90% 과다한 두 가지 프라이머보다 낮다. 실험에서, 이것은 PCR 주기의 수를 늘려 보상할 수 있다. 비대칭 PCR 반응이 충분한 ssDNA 를 생산할 수 없다면, 우리는 다른 유인물 비율을 시도해 볼 수 있다. B) 5- 10 PCR 주기 증가 C) 마지막 5 개 사이클에 더 많은 탭 중합 효소 (2U) 를 넣는다. D). 반대 비대칭 프라이머 비율을 시도해 보세요. 때때로, 반대 비대칭 프라이머의 비율은 다른 ssDNA 생산을 생산할 수 있다. 제한된 수의 PCR 프라이머나 내부 프라이머로 준비한 단일 체인 DNA 를 서열분석하고, 통상적인 방법으로 염기서열을 섞거나 표기하여 서열을 해독한다. 준비한 ssDNA 체인은 불연속적인 5'- 끝을 가질 수 있지만, 연장 중 조기 종료로 인해 3'- 끝 근처의 다른 지점에서 잘릴 수 있습니다. 그러나, 시퀀싱 반응에 사용된 모든 프라이머에 대해서는 완전한 ssDNA 만 시퀀싱 템플릿으로 사용될 수 있다.

최근 직접 염기서열분석을 위한 단일 사슬 핵산 템플릿을 준비하는 또 다른 방법이 보도됐다. 이 방법에는 PCR 프라이머에 파지 프로모터를 넣고, PCR 제품의 RNA 복사본을 옮긴 다음, 서열을 분석하지 않고 역전사 효소를 사용하는 것이 포함된다. 하지만 증강반응 후 효소 촉진 반응 단계와 역전사 효소를 시퀀싱효소로 사용하는 제한으로 인해 이 방법의 적용이 크게 제한되었다.

이중 가닥 DNA 템플릿

단일 가닥 DNA 템플릿

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비대칭 프라이머의 응용?

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