분자 교잡에 일반적으로 사용되는 몇 가지 교잡 기술
(1) Southern 잡교: 전기 영동은 DNA 조각을 분리하여 젤에서 질산섬유소 필터나 나일론 막으로 옮긴 다음 프로브와 교잡한다. 검출 대상은 DNA 이고 프로브는 DNA 또는 RNA 입니다.
(2) Northern 잡교: 전기 수영 후 RNA 조각을 젤에서 질산섬유소 여과막으로 옮긴 다음 프로브와 교잡한다. 검출 대상은 RNA 이고 프로브는 DNA 또는 RNA 입니다.
잡교에서 사용하는 방법에 따르면, 약간의 잡교, 슬롯 잡교, 균락 제자리 교배도 있다. 질산섬유소 필터, 나일론 막, Whatman 54 1 필터지 등 세 가지 고체상 지지물을 교잡에 사용할 수 있습니다. 각기 다른 브랜드의 나일론 막은 차별대우가 필요하며, DNA 고정과 교배는 공장 설명서에 엄격히 따라야 한다. Whatman 54 1 여과지의 습도가 높아 세균 군집을 선별하는 데 가장 먼저 사용되었다. 여과지는 주로 일부 유전자 문고를 선별하는 데 쓰인다. 고정화 DNA 의 잡교 조건은 기본적으로 질산섬유소 필터를 사용할 때 설정된 조건과 같다. Whatman 54 1 여과지는 질산섬유소 필터보다 몇 가지 장점이 있다. 더 싸고, 교잡하고, 내구성이 뛰어나며, 건조 과정에서 변형되고 부서지기 쉽다. 그러나 트랜스젠더 과정이 조심하지 않으면 교잡신호의 강도는 질산섬유소 필터를 사용하여 얻은 신호보다 현저히 약해질 것이다. 따라서 질산섬유소 여과막은 여전히 기존의 세균 선별과 각종 교잡의 고체상 지지물로 사용되고 있다. Southern 하이브리드는 제한 내체 효소 절단의 DNA 조각에 프로브와 동족인 시퀀스가 있는지 여부를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 다음 단계를 포함합니다.
(1) 효소 DNA, 겔 전기 영동으로 효소를 분리한 다음 제자리에서 DNA 를 변성시킨다.
(2) DNA 조각을 고체 지지물 (질산섬유소 필터막 또는 나일론 막) 으로 옮깁니다.
(3) 사전 교잡막으로 여과막의 비특이적 부위를 덮는다.
(4) 프로브를 동원DNA 조각과 교잡한 다음 비특이적 결합을 제거한 프로브를 씻어낸다.
(5) 현상기를 통해 표적 DNA 의 위치를 확인하십시오.
Southern 잡교에서 잡교 신호를 감지할 수 있는지 여부는 총 DNA 에서의 표적 DNA 의 비율, 프로브의 크기와 비율 활성, 필터막으로 전송되는 DNA 양, 프로브와 표적 DNA 간의 쌍을 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. 최적의 조건에서, 며칠 동안의 방사선 자기 현상 노출 후 Southern 교배는 0. 1pg 보다 활성이 작은 활성 프로브와 32 P 마크 (>: 109 cpm/μg) 의 상호 보완적인 DNA 비율을 민감하게 감지할 수 있다. 10μg 게놈 DNA 를 여과막으로 옮기면 수백 개의 뉴클레오티드 프로브와 교잡하여 밤새 노출되면 포유류 게놈에서 크기가 1kb 인 단일 복사 서열을 감지할 수 있다.
DNA 가 젤에서 고체상 지지물로 옮겨지는 데는 (1) 모세관 전이의 세 가지 주요 방법이 있습니다. 이 방법은 남방인이 발명한 것이기 때문에 남방 이동 (또는 각인) 이라고도 한다. 모세관 이전법의 장점은 간단하여 다른 기구가 필요하지 않다는 것이다. 단점은 전송 시간이 길고 전송 후 하이브리드 신호가 약하다는 것입니다. (2) 전기 영동 전이. DNA 변성 후 전기 영동을 통해 전기를 띤 나일론 막으로 옮길 수 있다. 이 방법의 장점은 탈 퓨린/가수 분해가 필요하지 않고 더 큰 DNA 조각을 직접 전송할 수 있다는 것입니다. 단점은 전송 중 전류가 커서 온도를 조절하기 어렵다는 것이다. 전기 수영 전이는 일반적으로 모세관 전이와 진공 전이가 유효하지 않은 경우에만 사용됩니다. (3) 진공 이송. 상업용 진공 이송 장비가 많이 있습니다. 일반적으로 질산섬유소 막이나 나일론 막을 진공실 위의 다공성 인터넷에 올려놓은 다음 젤을 여과막 위에 놓고 완충액이 위 저장액에서 흘러내려 젤의 DNA 를 씻어내고 여과막 위에 퇴적한다. (데이비드 아셀, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 질산섬유소, 질산섬유소, 나일론, 나일론) 이 방법의 장점은 정상 두께 (4-5mm) 와 정상 진지당 농도 (
1, 재료: DNA 테스트, 프로브 표시.
2. 설비: 전기영기, 전기영통, 플라스틱 대야, 진공로, 방사자기 현상기 상자, 엑스레이, 교잡백, 질산섬유소 막 또는 나일론 막, 여과지.
3. 시약:
(1) 10 밀리그램/밀리리터 브롬화 B (EB).
(2)50×Denhardt 용액: 5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA 물을 500 밀리리터에 넣고 여과멸균하여-20 C 에 보관한다.
(3) 1× 브로토: 탈지 분유 5g, 0.02% 아 지드 나트륨, 4 C 보존.
(4) 프리하이브리드액: 6× SSC, 5× Denhardt, 0.5% SDS, 100 mg/ml 연어 정제 DNA, 50% 메틸아미드.
(5) 교배액: 사전 교배액에 트랜스젠더 프로브를 넣으면 교배액이다.
(6)0.2 몰/리터 염산.
(7)0. 1% 도데 실 황산나트륨.
(8)0.4 무어/수산화나트륨.
(9) 트랜스젠더 용액: 염화나트륨 87.75 그램, 수산화나트륨 20.0 그램을 1000 밀리리터에 넣는다.
(10) 중화 용액: 175.5g NaCl, 6.7g Tris Cl Cl, 1000ml 에 물을 추가합니다.
(1 1) 질산섬유소 여과막.
(12) 20× SSC: 3 mol/L NaCl, 0.3 mol/L 구연산 나트륨, 1mol/L HCl 로 pH 를 7.0 으로 조정;
(13)2×, 1×, 0.5×, 0.25× 및 0. 1×SSC: 20×SSC 사용
4, 절차:
(1) 10pg- 10μg 의 DNA 를 약 50μl 의 부피로 소화한 다음 아가로 오스 겔에서 전기 영동12-20
(2) 25μl 10mg/ml 브롬화 을을 500 ml 물에 넣고 젤을 30 분 동안 염색한 후 사진을 찍습니다.
(3) 다음 용액으로 젤을 처리하고 부드럽게 흔들어주세요: 500ML 500ML 0.2MOL/L HCL10+00 분, 용액을 버리세요 (제한적 단편인 경우 >:100 500ml 변성 용액을 두 번, 매번 15 분마다 용액을 붓는다. 500 밀리리터 중화 용액 30 분. 나일론 막으로 교잡하면 이 단계는 생략할 수 있다.
(4) 장갑을 끼고 그릇에 20×SSC 용액을 넣고 먼저 무균수로 질산섬유소 필터를 완전히 적신 다음 20×SSC 로 적십니다. 질산섬유소 여과막을 한 번에 정확하게 젤에 덮어서 거품을 제거한다. 20×SSC 용액에 담근 여과지 3 장으로 여과막을 덮은 다음 건조한 여과지 3 장과 마른 휴지를 넣어 DNA 의 복잡성에 따라 2- 12 시간을 옮긴다. 나일론 필름 하이브리드를 사용할 때는 막을 물에 한 번 담가 전이할 때 20×SSC 대신 0.4mol/L NaOH 를 사용할 수 있다. 간단한 각인 전송은 2 ~ 3 시간이 걸리며, 게놈 각인의 경우 옮기는 데 시간이 오래 걸린다.
(5) 티슈를 제거하고 파란 볼펜으로 필터 오른쪽 위 모서리에 전송 날짜를 적어 표시를 하고 필터를 제거하고 2×SSC 에서 5 분 동안 세척한 후 80 C 에서 2 시간 동안 굽는다. 나일론 막으로 교배할 때는 건조할 수 있을 뿐 굽지 않도록 주의하세요.
(6) 6- 10ml 사전 교잡액이 들어 있는 밀폐된 작은 비닐봉지에 필터를 넣고, 사전 교잡액을 주머니 바닥에 넣고 앞뒤로 자루를 짜서 여과막을 촉촉하게 한다. 일정 온도 (보통 37-42 C) 에서 사전 교잡한 3-65438 02 시간 동안 사전 교잡액을 버린다.
(7) 동위 원소 표지 프로브 (1 섹션 참조) 를 준비하고 프로브를 5 분 동안 끓인다.
(8) 프로브를 하이브리드에 넣고 골고루 섞는다. 단계 (6) 에서 설명한 대로 밀폐된 비닐봉지에 혼합용액을 주입하고 사전 교배와 같은 온도에서 6-65438 02 시간을 교배합니다.
(9) 여과막을 꺼내고 다음 용액으로 부드럽게 흔들어주세요: 실내 온도, 1× SSC/0. 1% SDS, 15 분 잡교 온도에서 0.25× SSC/0. 1% SDS, 15 분, 두 번.
(10) 질산섬유소 필터를 건조시켜 엑스레이에 노출한다. DNA 스트립은 일반적으로 1-2 일 후에 노출됩니다. Gap 에서 번역된108CPM/μ G 프로브의 경우 10μg 포유류 DNA 에서 10pg 의 단일 복사 유전자를 쉽게 감지할 수 있습니다. 북방 교잡과 남방 교잡은 매우 비슷하다. 주요 차이점은 검출된 대상이 RNA 이며, 전기 영동은 트랜스젠더 조건 하에서 이루어지며 RNA 의 2 차 구조를 제거하여 RNA 가 분자 크기에 따라 완전히 분리되도록 한다는 점이다. 트랜스젠더 전기 영동에는 아세탈 트랜스젠더 전기 수영, 포름알데히드 트랜스젠더 전기 수영, 메틸수은 트랜스젠더 전기 수영 등 세 가지가 있다. 전기 수영 후, RNA 는 Southern 과 같은 방식으로 진지당 젤을 통해 질산섬유막으로 옮긴 다음 프로브와 교배한다.
1. 재료: 테스트할 RNA 및 준비된 프로브.
2. 설비: 전기영기, 전기영통, 플라스틱 대야, 진공로, 방사자기 현상상자, 엑스레이, 잡교백, 질산섬유소 막 또는 나일론 막.
3. 시약:
(1) 20× sspe:175.3g NaCl, 88.2 g 레몬산 나트륨, 800ml 물에 용해10mol/
(2) 기타 시약: Southern 잡교 시약, 모든 시약 DEPC 로 처리한다.
4, 절차:
(1)RNA 는 트랜스젠더와 전기 수영 후 아세트알데히드 아세틸 RNA 를 질산섬유소 여과막으로 즉시 옮길 수 있다. 전송 방법은 DNA 전송 방법과 유사합니다.
(2) 이동 후 실온에서 6×SSC 용액에 막을 5 분 동안 담가 진지당 조각을 제거한다.
(3) 혼성 필름을 두 여과지 사이에 끼우고 80 C 의 진공 오븐에서 0.5-2 시간 동안 건조한다.
(4) 다음 두 용액 중 하나와의 사전 교배 1-2 시간. 42 C, 50% 메틸아미드, 5×SSPE, 2× 덴하트 시약, 0. 1% SDS 조건 하에서 진행된다면 사용해야 합니다. 68 C 에서 진행하는 경우 6×SSC, 2×Denhardt 시약 및 0. 1% SDS 를 사용해야 합니다 (참고: BLOTTO 는 Northern 교잡에 사용할 수 없음).
(5) 사전 잡교 용액에 트랜스젠더 방사성 마크를 첨가한 프로브. 저풍도 mRNA 를 탐지하는 경우 사용되는 프로브의 양은 최소 0. 1μg 여야 하며, 활동보다 2× 108 cpm/ min μ g 를 크게 하여 적절한 온도 조건에서 하이브리드/KLOC-0 에 배치해야 합니다.
(6) 실온에서 1×SSC 와 0. 1% SDS 로 20 분 동안 세탁한 다음 68 C 에서 0.2×SSC 와 0.1을 사용한다
(7) X-레이 필름 (코닥 XAR-2 또는 이와 동등한 제품) 으로 방사선 자체 현상하고-70 C 에서 24-48 시간을 노출합니다.
[참고]
(1) 진지당 농도가 1% 보다 높거나 젤 두께가 0.5cm 보다 크거나 분석할 RNA 가 2.5kb 보다 큰 경우 0.05mol/LNaOH 에 젤을 20 분 동안 담가 RNA 부분을 가수 분해해야 합니다 물에 담근 후 DEPC 로 처리한 물로 젤을 씻고 20×SSC 로 45 분 동안 담그세요. 그런 다음 여과막으로 옮깁니다.
(2) 단계 (3) 작업에서 필터에 아세트알데히드 RNA 가 포함되어 있는 경우 교잡하기 전에 20 mmol/L tris Cl (pH 8.0) 로 65 C 에서 필터를 씻어서 RNA 에서 아세탈 분자를 제거해야 합니다.
(3) 젤에서 나일론 막으로 RNA 를 옮기는 방법은 RNA 를 질산섬유소 여과막으로 옮기는 방법과 비슷하다.
(4) RNA 이동 전에 포름알데히드를 함유한 젤은 DEPC 가 처리한 물로 몇 차례 세탁하여 포름알데히드를 제거해야 한다. 나일론 막을 사용하여 교잡할 때 양전하를 띤 나일론 막은 알칼리성 용액에서 핵산을 고정할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 7.5mmol/LNaOH 용액으로 진지당 중 아세트알데히드 RNA 를 씻어내야 하며, RNA 를 부분적으로 가수 분해하여 RNA 분자 길이 (>: 2.3kb) 의 전송 속도와 효율을 높일 수 있다. 또한, 염기는 mRNA 분자의 글리 옥살 가합물을 제거 할 수 있으며, 고정 후 세척하는 단계를 제거 할 수 있습니다. 알칼리성 조건에서 아세트 알데히드 아실 RNA 를 양전하가 있는 나일론 막으로 옮기는 작업도 DNA 전송을 통해 이루어지지만 전송 버퍼액은 7.5mmol/LNaOH 입니다. 이동 후 (4.5-6.0 시간) 나일론 필름은 2×SSC 와 0. 1%SDS 로 일정 기간 헹구어 실온에서 말려야 한다.
(5) 나일론 필름의 단점은 배경이 높다는 것이다. 특히 RNA 프로브를 사용할 때는 더욱 그렇다. 여과막을 고농도 알칼리성 용액에 장시간 두면 잡교 배경이 눈에 띄게 높아지며, 사전 잡교 및 잡교 단계에서 폐쇄제의 양을 늘려 해결할 수 있다.
(6) 중성 완충액을 사용하여 RNA 전송을 하면 이동 후 건조한 나일론 막을 두 여과지 사이에 끼우고 80 C 에서 0.5 ~ 2 시간 동안 건조시키거나 파장이 254nm 인 자외선으로 나일론 필름의 RNA 면을 비춘다. 후자의 방법은 더 복잡하지만, 일부 배치의 양전하가 있는 나일론 막의 잡교 신호는 이 처리 후에 증강될 수 있기 때문에 바람직하다. 그러나 최상의 결과를 얻기 위해서는 나일론 막이 과도하게 노출되지 않도록 보장해야 한다. 적당한 조사는 RNA 의 소량의 염기와 나일론막 표면에 양전하를 띠고 있는 아미노가 교차 구조를 형성하도록 하는 반면, 과도한 조사는 RNA 의 일부 흉선 피리미딘과 나일론막 표면을 결합시켜 잡교 신호를 약화시킨다. 이 방법은 여러 한천 플레이트에 흩어져 있는 소수의 식민지 (100-200) 를 복제하고 필터링하는 데 사용할 수 있습니다. 이 균을 주 진지판에 통합하고 질산섬유소 필터를 두 번째 진지판의 표면에 놓습니다. 일정 기간 배양한 후 균락이 제자리에서 분해되었다. 보드는 필터링 결과를 얻을 때까지 4 C 아래에 저장해야 합니다.
1. 재료: 테스트 대상 세균판, 마크 프로브, 질산섬유소 필터 등.
2. 설비: 항온오븐, 항온수욕, 데스크탑 고속 원심분리기 등.
3. 시약:
(1) 파운드 고체 배양기.
(2)0.5 무어/수산화나트륨.
(3) 1 무어/리터 Tris Cl.
(4) 1.5 무어/염화나트륨 리터.
(5)0.5 무어/리터 Tris Cl.
(6) 사전 로션: 5× SSC, 0.5% SDS, 1 mmol/L EDTA (pH 8.0).
(7) 사전 잡교 용액: 50% 메틸아미드, 6×SSC (또는 6×SSPE), 0.05×BLOTTO (메틸아미드 필요 없음).
(8) 기타 시약: Southern 과 교잡하다.
4, 절차:
1. 일부 식민지를 질산섬유소 여과막으로 옮깁니다.
(1) 질산섬유소 필터를 선택적 항생제가 함유된 진지판에 올려놓는다.
(2) 무균 이쑤시개로 각 식민지를 여과막으로 옮긴 다음 선택적 항생제를 함유하고 있지만 여과막이 없는 진지 보드로 옮긴다. 선형 접종 (또는 점형 접종) 은 일정한 그리드에 따라 진행해야 한다. 각 식민지는 두 플레이트의 같은 위치에 표시해야 합니다. 마지막으로, pBR322 와 같은 비 재조합 플라스미드를 함유 한 식민지를 여과막과 마더 보드에 동시에 그립니다.
(3) 표시된 식민지가 폭이 0.5-65438 0.0mm 가 될 때까지 플레이트를 거꾸로 37 C 에서 배양한다 .....
(4) 방수 검은색 페인트 잉크가 있는 주사기 바늘로 진지에 도달할 때까지 필터를 관통하고 세 개 이상의 비대칭 위치에 표시를 합니다. 대략 같은 위치에 마더 보드를 표시합니다.
(5) 파라핀막으로 마더보드를 밀봉하고 교잡반응 결과를 얻을 때까지 4 C 에서 거꾸로 보관한다.
(6) 세균을 용해하고 본 단락 아래에 설명된 방법에 따라 방출된 DNA 를 질산섬유소 여과막과 결합한다.
식민지 크래킹과 DNA 및 니트로 셀룰로오스 여과막의 결합
(1) 플라스틱 랩에 0.5mol/L NaOH 로 가득 찬 작은 움푹 패인 (0.75ml) 을 만들어 균락이 위를 향하게 하고, 필터를 오목한 곳에 놓고, 플라스틱 랩을 평평하게 하여 필터를 고르게 촉촉하게 하고, 필터를 제자리에 2-3 분 동안 놓습니다
(2) 마른 휴지로 필터 아래쪽에서 건조막을 빨아들이고, 새로운 랩과 새로 배합된 0.5mol/L NaOH 로 단계 (1) 를 반복합니다.
(3) 건조막을 빨아들여 1 mol/L tris Cl (pH 7.4) 이 있는 새로운 플라스틱 막 함몰로 옮깁니다. 5 분 후, 건조 필터를 빨고 이 단계를 다시 반복합니다.
(4) 흡입막은 1.5mol/L NaCl 과 0.5 mol/L Tris Cl (pH 7.4
(5) 두 개의 건조 여과지 사이에 필터를 끼우고 80 C 의 진공 오븐에서 2 시간 동안 건조시켜 DNA 를 고정시킨다.
(6) 막에 고정 된 DNA 와 32 p 표지 프로브를 교배한다.
교차
(1) 2×SSC 가 장착된 플라스틱 트레이로 건조된 필터를 액면 위에 띄우고 5 분 동안 충분히 담그세요.
(2) 필터를 200 밀리리터의 예세제가 들어 있는 유리그릇으로 옮긴다. 여과막을 겹쳐서 용액에 넣다. 플라스틱 랩으로 유리 그릇을 덮고 배양함 안의 회전 플랫폼 위에 놓아라. 50 C 에서 30 분 동안 처리하다. 이 단계와 모든 후속 단계에서는 필터가 함께 붙지 않도록 필터를 천천히 흔들어야 합니다.
(3) 사전 세제에 담근 탈지면지로 막 표면의 세균 파편을 가볍게 닦아서 양성 잡교 신호의 강도와 선명도에 영향을 주지 않고 교잡 배경을 낮춘다.
(4) 필터를 150ml 사전 잡교액이 포함된 유리로 옮기고 적절한 온도에서 1-2h (수용액 68 C, 50% 메틸아미드 잡교 42 C) 를 미리 섞는다.
(5) 32 P 로 표시된 이중 체인 DNA 프로브를100 C 에서 5 분 동안 가열하여 얼음욕에 빠르게 넣는다. 단일 체인 프로브는 변성할 필요가 없습니다. 프로브를 잡교 백에 넣고 교잡하여 밤을 보내다. 교잡할 때, 여과막을 담은 용기는 액체가 증발하지 않도록 단단히 덮어야 한다.
(6) 잡교 후 잡교액을 제거한 후 즉시 필터를 입실 온도 아래 2×SSC 와 0. 1% SDS 의 대량 (300-500ml) 용액에 가볍게 5min 을 흔들어 적어도 한 번은 뒤집는다. 막이 마르는 것을 피하면서 한 번 반복해서 세척한다.
(7) 300-500ml 1× SSC 와 0. 1% SDS 용액으로 68 C 에서 막을 두 번 청소합니다. 매번1-/KK 배경이 높거나 실험 요구 사항이 엄격하면 300-500 ml 의 0.2× SSC 와 0. 1% SDS 용액을 68 C 에 담근 60 분 동안 사용할 수 있습니다.
(8) 티슈 위에 필터를 놓고 실온에서 말린 다음 필터 (번호 위로) 를 랩에 올려놓고 랩에 비대칭적인 표시를 해 방사성 방사선이 현상필름 위치에 맞도록 한다.
(9) 2 층 플라스틱 필름으로 필터를 덮습니다. X 선 필름과 증감 스크린으로-70 C 에서 12- 16 시간 노출.
(10) 필름이 현상된 후 필름에 투명 판지를 붙이다. 종이에 교잡양성 신호의 위치를 표시하고 비대칭 분포점의 위치를 표시한다. 투명지를 여성에서 꺼낼 수 있으며, 양성균락은 종이의 점을 진지의 점과 비교하여 확인할 수 있다. 점 교잡이란 DNA 또는 RNA 샘플을 질산섬유소 필터막에 직접 점화한 다음 핵산 프로브 분자와 교잡하여 샘플에 특정 DNA 나 RNA 가 있는지 여부를 나타내는 것이다. 서로 다른 시간에 같은 샘플을 희석하여 반정량 결과를 얻을 수 있다. 따라서 DNA 나 RNA 분석은 유전자 분석과 유전자 진단에 자주 사용되는 간단하고 신속하며 경제적인 방법으로 유전자 표현을 연구하는 강력한 도구이다. 그러나 과녁 서열은 비과녁 서열과 분리되지 않았기 때문에 과녁 서열의 길이를 알 수 없다. 특히 배경 간섭이 큰 경우 대상 시퀀스 신호와 간섭 신호를 구분하기가 어렵습니다.
1. 재료: 분석할 DNA 또는 RNA 샘플, 프로브 표시.
장비: 슬롯 샘플러, 진공 펌프, 항온수욕, 진공로 등.
3. 시약:
(1) 100% 포름 아미드.
(2) 포름 알데히드 (37%).
(3) 20×SSC.
(4)0. 1 무어/수산화나트륨.
(5) 니트로 셀룰로오스 여과막.
(6) 여과지.
4, 절차:
(1) 10μl 샘플은 20μl 100% 포름 아미드, 7μl 37% 포름 알데히드 및 2μl 20×SSC 와 혼합됩니다. 섞은 후 68 C 의 얼음욕에 15 분 넣는다.
(2) 0. 1mol/L NaOH 로 샘플러를 청소한 다음 무균수로 충분히 헹구십시오. 샘플러에 20×SSC 에 담근 필터지를 깔고, 20×SSC 에 담근 질산섬유소 필터 1 시간을 깔고, 클램프를 덮고 진공펌프를 켜라.
(3) 10×SSC 로 각 구멍을 청소합니다. 각 샘플에 볼륨의 두 배인 2×SSC 를 넣고 섞은 후 샘플을 구멍에 넣는다. 2μl 염료를 몇 개의 주변 구멍 위치에 넣고 천천히 빨아들인다. 1 밀리리터 10×SSC 로 구멍당 두 번 청소합니다. 5 분 동안 계속 흡입하고 건조막을 빨아들인다.
(4) 여과막을 꺼내 여과지 두 장 사이에 끼우고 80℃ 진공 건조 2 시간. 앞서 Southern 또는 Norhtern 잡교에서 설명한 바와 같이 방사성 표기의 프로브와 교잡합니다.
[참고]
1. 방사자현상할 때는 필터막이 건조해야 하고 랩으로 덮어야 합니다. 그렇지 않으면 필터막이 엑스레이에 달라붙어 향후 조작에 어려움을 겪을 수 있습니다.
2. 잡교 과정에서 전체 여과막은 항상 촉촉하게 유지되어야 하며 건조해서는 안 된다.
섹션 iii 하이브리드 반응 조건 및 매개 변수 최적화
하이브리드 화 결과에 대한 다른 반응 조건의 영향은 다음과 같습니다.
(1) 잡교액의 부피에 따라 잡교시간을 결정한다. 일반적으로 작은 부피의 잡교액을 사용하는 것이 좋다. 작은 부피의 용액에서는 핵산 페어링이 빠르고 프로브 사용량이 적기 때문에 여과막의 DNA 가 반응에서 주된 역할을 하기 때문이다. 그러나 교잡 과정에서 교잡막을 덮을 수 있는 충분한 교잡액이 있는지 확인해야 한다.
(2) 사용된 잡교액에 따라 잡교온도를 결정한다. 일반적으로 교잡상은 수용액일 때 68 C 교배, 50% 메틸아미드 용액에서는 42 C 교배한다.
(3) 덴하트 시약, 헤파린 또는 5% 탈지 분유로 구성된 블롯 토와 같은 다른 폐쇄 시약 선택. 이 시약 들은 깨진 연어 정자 DNA 나 효모 DNA 를 넣어 SDS 와 함께 사용해야 한다. Denhardt 의 시약 대비 BLOTTO 는 저렴하고 사용하기 쉽고 만족스러운 결과를 얻을 수 있지만 RNA 교잡에는 사용할 수 없습니다. 일반적으로 나일론 막은 BLOTTO 보다 Denhardt 시약 를 사용하여 더 높은 신호 대 잡음비를 얻을 수 있습니다. 질산섬유소 여과막의 경우, 폐쇄제는 보통 사전 잡교 용액과 잡교 용액에 포함되어 있다. 하지만 나일론 막의 경우 잡교액에서 폐쇄제를 생략하는 경우가 많다. 고농도의 단백질이 탐침과 과녁 유전자의 퇴화를 방해할 수 있기 때문이다.
(4) 교배 과정에서 필요에 따라 다른 진동 방법과 정도를 선택합니다. 많은 잡화막이 함께 반응할 때, 연속적인 경미한 진동은 더 나은 잡화 결과를 얻을 수 있다.
(5) 잡교 과정에서 반응체계에 10% 황산 글루칸 또는 10% PEG 와 같은 다른 화합물을 첨가하면 교배 속도가 약 10 배 빨라질 수 있다. 이 방법은 일반적으로 희귀 시퀀스를 감지하는 데 사용되지만 용액의 점도로 인해 높은 배경과 작동하기 어려운 경우가 있습니다. 따라서 필터막에 들어 있는 표적 DNA 의 양이 적거나 방사성 프로브의 양이 제한되어 있지 않는 한 황산 글루칸이나 PEG 는 일반적으로 사용되지 않습니다.
(6) 프로브와 검사 대상 사이의 동원성에 따라 청결도를 선택합니다. 고도의 동원성이 있다면 촘촘한 용출 모드 (고농도 SSC) 를 선택할 수 있고, 그렇지 않으면 촘촘하지 않은 용출 모드 (저농도 SSC) 를 선택할 수 있다. 세탁은 보통 하이브리드체12-20 C 이하의 해체온도에서 진행된다. 체인 해제 온도 (Tm) 는 이중 체인 DNA 또는 RNA 분자 변성이 별도의 단일 체인을 형성할 때 흡광도가 증가하는 중간점 온도입니다. 일반적으로 G C 염기쌍이 풍부한 시퀀스의 Tm 온도는 at 염기쌍이 풍부한 시퀀스보다 높다. Tm 계산 방법은 8 장을 참조하십시오.
(7) 표기 프로브의 농도와 비율에 따라 다른 잡교 조건과 검출 방법을 선택한다. 일반적으로 새로운 동위원소를 사용하면 강한 신호를 얻을 수 있다.
(8) 수용액에서 교잡할 때 6×SSC 와 6×SSPE 용액의 효과는 같다. 그러나 메틸아미드 용액에서 교잡할 때는 완충력이 더 강한 6×SSPE 를 사용해야 한다.
이러한 조건의 변화는 잡교 결과에 다른 영향을 미치므로 연구의 구체적인 조건에 따라 적절한 방법을 선택해야 한다.