고도로 보수적 인 두 유전자, qPCR 을 만드는 방법?
일반적으로 real-time qPCR MasterMix 는 2× 의 농축액으로 템플릿과 프라이머만 넣으면 됩니다. Real-time qPCR 감도가 높기 때문에 샘플당 최소 3 개의 평행 구멍을 만들어야 합니다. 이후 데이터 분석에서 Ct 차이가 많거나 SD 가 너무 커서 통계 분석을 할 수 없습니다. 일반적으로 반응 시스템의 최종 농도는 1-4mM； 입니다. 템플릿인 경우 총 RNA 는 일반적으로 1ng-5 이고, cDNA 는 보통 1ul 또는 1ul 의 1 배 희석액이며, 목적유전자의 표현 풍도에 따라 조정해야 한다. 물론 이들은 모두 경험치이며, 운영 과정에서 사용된 마스터 믹스, 템플릿, 프라이머에 따라 최적화해 최적의 반응 체계를 달성해야 한다. 반응체계 구성 과정에서 주의해야 할 점은 다음과 같습니다. < P > 1. 마스터 믹스 (Mastermix) 는 반복적으로 얼지 말고 자주 사용하는 경우 용해한 후 4 도에 두는 것이 좋습니다.
2. 추가 샘플 오류를 줄이기 위해 Mix 를 더 많이 준비합니다. 얼음 위에서 조작할 수 있는 것이 가장 좋다.
3. 모든 튜브 또는 구멍마다 새로운 총을 교체해야 합니다! 같은 총으로 계속 견본을 붙이지 마라!
4. 모든 성분을 첨가 한 후 원심 분리에 의한 기포 제거.
5. 샘플당 최소 3 개의 평행 구멍이 있습니다. < P > 비교 또는 보정 염료 (reference dye, passive dye) 는 ROXTM (현재 ABI 의 등록 상표) 으로 자주 사용됩니다! ) 또는 다른 염료는 PCR 산물 검출의 형광값에 영향을 주지 않는 한 된다. 기준 염료의 역할은 형광정량반응에서 비 PCR 진동을 표준화하고, 샘플 오차 또는 구멍과 구멍 사이의 오차를 보정하여 안정적인 기준선을 제공하는 것이다. 현재 많은 회사들이 이미 ROXTM 을 마스터믹스 (MasterMix) 나 Premixture (Premixture) 에 배합했다. 반응 곡선이 양호하거나 반응 체계를 최적화한 경우 ROXTM 염료 보정을 추가하지 않아도 됩니다. < P > 일반적으로 real-time qPCR 의 반응 프로그램은 일반 PCR 과 같이 변성, 어닐링, 확장 3 단계가 필요하지 않습니다. 제품 길이가 8-15bp 사이이기 때문에 트랜스젠더와 어닐링만 하면 됩니다. SYBR@Green 과 같은 염료법은 PCR 증폭 절차가 끝난 후 용해 절차를 추가하여 용해 곡선을 형성하고 PCR 산물의 특이성 증폭을 판단하는 것이 좋다. 용해 프로그램, 기기에는 기본 설정이 있거나 약간 다르지만, 모두 산물이 용해될 때 형광신호를 수집하는 것이다.
3. 기기 설정
모든 기기 작업은 기본적으로 동일합니다. 설정할 때 반응 보드 설정 (plate setup) 과 프로그램 설정 (program setup) 이 포함됩니다. ABI StepOne 을 예로 들어 반응 설정 < P > A. 먼저 실험 목적 선택: 정량 또는 기타. 우리는 "BioTeke" 라는 이름으로 "정량" 실험을 했습니다. < P > B. 실험 방법 선택: Ct 를 비교하는 SYBR Green 방법, f.a.s.t. 프로그램, cDNA 를 템플릿으로 사용했습니다. < P > C. 목적 유전자의 설정: 몇 가지 목적 유전자와 목적 유전자의 이름이 있다. < P > D. 샘플 설정: 어느 것이 실험팀인지, 어느 것이 대조군인지 포함한다. 부정적인 통제 설정과 생물학적 반복 설정을 가지고 있습니다. < P > E. 대조군과 내삼 유전자 설정: 이것은 다음 정량을 위한
F. 반응절차의 설정입니다. PCR 반응절차의 설정은 다른 회사의 마스터 믹스 (MasterMix) 를 기준으로 합니다. 예를 들어 BioTeke 의 95 C 2 분이면 DNA 중합 효소 (ABI 는 1 분 소요) 를 활성화시킬 수 있습니다. 순환반응은 95 C 15 초, 6 C 15 초의 4 개 순환이다. 용해 곡선 프로그램은 기기 기본 설정을 사용하면 됩니다. 아니면 계기설명서에 제시된 절차일 수도 있습니다.